גנטיקה קלאסית של תכונות איכותיות וכמותיות ביפעה גדולת פרחים, ליזיאנטוס

Transcript

1 גנטיקה קלאסית של תכונות איכותיות וכמותיות ביפעה גדולת פרחים, ליזיאנטוס Eustoma grandiflorum) עבודת גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית של האוניברסיטה העברית בירושלים לשם קבלת תואר "מוסמך למדעי החקלאות" על ידי אביחי עמרד אוגוסט 2009 אלול תשס"ט רחובות

2

3 עבודה זו נעשתה בהדרכתו של פרופ' דני זמיר המכון למדעי הצמח וגנטיקה בחקלאות הפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה.סמית, האוניברסיטה העברית בירושלים, רחובות.

4

5 1. תקציר יפעה גדולת פרחים, ליזיאנטוס grandiflorum,,eustoma הינו פרח קטיף ועציץ שמקורו בדרום מרכז ארה"ב. הליזיאנטוס שייך למשפחת הערבזיים,,Gentianaceae מקבוצת ה- Euasterid. מין הבר הינו בעל צבע כחול-סגול ודור יחיד של עלי כותרת. בשלושים השנים האחרונות נעשו עבודות טיפוח רבות שמטרתן הגדלת המבחר והמופע החיצוני של הפרח. הטיפוח שנעשה עד כה התבסס על שיטות טיפוח קלאסיות בלבד ואינו נעזר בביולוגיה מולקולארית. פרחיו הגדולים, גבעוליו הארוכים וחיי מדף ממושכים הפכו את היפעה לגידול בעל פופולאריות גדלה. כיום ישנם זנים בעלי מבחר צבעים: לבן, ורוד, קרם, כחול ועוד, בעלי דור יחיד או מספר דורים. כל הזנים המסחריים הנם זני מכלוא. ניפחו של גידול הליזיאנטוס בארץ גדל מדי שנה כאשר יתרונו של המגדל הישראלי מצוי בעונת השיווק החורפית כמו גם בזנים בעלי מספר הדורים פרח כפול). עקב היותו של הליזיאנטוס גידול חדש יחסית קיים מעט מאד מידע גנטי אודותיו ומעט פרסומים עוסקים בהורשת תכונותיו. עבודה זו מתמקדת בבניית תשתית מחקרית וטיפוחית לליזיאנטוס. על מנת ליצור בסיס גנטי רחב ככל הניתן, טופחו יותר מ- 400 קווי סלקציה ברמת קיבוע גנוטיפי ופנוטיפי משתנה, בנוסף, נבנו שתי אוכלוסיות מתפצלות, בין מיניות, תוצרי הכלאה של שני קווי טיפוח הומוזיגוטיים ומין הבר.Eustoma exaltatum קטלוג פנוטיפי רחב, הכולל 86 מדדים שונים, שימש במשך שנתיים לאפיון האוכלוסיות הבין מיניות בדורות משתנים של הפריות עצמיות והכלאות מחזירות. בסה"כ אופיינו ע"י המדדים השונים למעלה מ צמחים. אפיון פנוטיפי רחב היקף זה ישמש בעתיד לבניה של מפה גנטית בליזיאנטוס, אשר תקדם את המחקר בליזיאנטוס ותאפשר פיתוח של כלים מולקולאריים לטיפוח. אפיון פנוטיפי של מספר תכונות פשוטות הוביל לחשיפה של חמישה גנים בעלי הורשה מנדלית המעורבים בקביעת הצבע והמראה של הפרח. הגנים אופיינו על אוכלוסיות ברקעים גנטיים שונים ודרכי ההורשה שלהן נחשפו מתוך עבודה עם משפחות מתפצלות שונות כמו גם עם האוכלוסיות הבין מיניות. בעבודה זו זוהו הגנים הבאים: 1. פרח כפול- זהו גן יחיד בו האלל הדומיננטי מביא ליצירה של פרח כפול. אפיון הגן בוצע באופן נרחב באחת האוכלוסיות הבין מיניות בדורות שונים של הפריות עצמיות והכלאות מחזירות כמו גם על מספר קווי סלקציה. בסה"כ זוהה הגן ב- 17 אוכלוסיות שונות. 2. שני גנים הפועלים במנגנון של אפיסטזיס רצסיבי קובעים את צבע הפרח: א. פרח לבן- זהו גן יחיד בו הומוזיגוטיות לאלל הרצסיבי גורמת ליצירה של צבע פרח לבן. האלל הדומיננטי מוביל ליצירת צבע ורוד או סגול עם תלות במצבו של הגן לפרח סגול. אפיון הגן בוצע באופן נרחב באחת האוכלוסיות הבין מיניות, בדורות שונים של הפריות עצמיות והכלאות מחזירות כמו גם על מספר קווי סלקציה. בסה"כ זוהה הגן ב- 28 אוכלוסיות שונות. א

6 ב. פרח סגול- זהו גן יחיד בעל תלות מסוג אפיסטזיס רצסיבי בגן לצבע לבן. האלל הדומיננטי מוביל לצבע פרח סגול ואילו הפנוטיפ הרצסיבי הינו צבע פרח ורוד. אפיון הגן בוצע באופן נרחב בשתי האוכלוסיות הבין מיניות בדורות שונים של הפריות עצמיות והכלאות מחזירות כמו גם על מספר קווי סלקציה. בסה"כ זוהה הגן ב- 26 אוכלוסיות שונות. 3. דו-צבע- זהו גן יחיד בו האלל הדומיננטי גורם ליצירה של תצורת דו-צבע בעלה הכותרת, הגן זוהה ב- 6 אוכלוסיות שונות מתוך קוו הסלקציה. 4. תצורת שמפניה- זהו גן יחיד בו האלל הרצסיבי גורם ליצירה של תצורת שמפניה בעלה הכותרת, הגן זוהה ב- 8 אוכלוסיות שונות מתוך קווי הסלקציה. מלבד החשיבות של העבודה להתפתחות המחקר בליזיאנטוס, מחקר זה משמש ועשוי לשמש גם בעתיד, מודל לעבודה עם "גידול יתום" Crop) Orphan בסביבת המחקר המודרנית. שייכותו של הליזיאנטוס לקבוצת ה Euasterid תשמש מקרה בוחן ליכולתנו לבצע ביולוגיה השוואתית ומיפוי יחסית לאורגניזם הנחקר הקרוב ביותר לליזיאנטוס הקפה. ב

7 א-ב תוכן העניינים: 1. תקציר 2. רשימת קיצורים 3. מבוא 3.1. ליזאנטוס, רקע 3.2. טקסונומיה 3.3. טיפוח טיפוח, כללי טיפוח, ליזיאנטוס 3.4. עבודות מחקר בליזיאנטוס צבע גנטיקה 3.5. תורשה של צבע פרח 3.6. תכונות כמותיות מורכבות "Phenom Networks" ליזיאנטוס בישראל 4. מטרות המחקר 5. שיטות וחומרים 5.1. חומר צמחי ליזיאנטוס, Eustoma grandiflorum Eustoma exaltatum עונות גידול קיץ קיץ אביב אביב

8 i-ii 5.3. בניית אוכלוסיות מחקר גנטיות 5.4. ייצור שתילים 5.5. האבקות עצמיות זרות 5.6. איסוף פירות וזרעים 5.7. אפיון פנוטיפי בדיקת תכונות איכותיות- בדידות יצירה של קטלוג פנוטיפי רחב לתכונות כמותיות ובדידות 5.8. ניתוח סטטיסטי Phenom Network.5.9 תוצאות 6.1. מס' הדורים של עלי כותרת 6.2. צבע עלי כותרת 6.3. תצורת הצבע בפרח. דיון ומסקנות 7.1. הורשה של תכונות בדידות בליזיאנטוס הומוזיגוטיות ההורה הלבן סטיות מהיחסים הצפויים פנוטיפ תצורת דו-צבע + שמפניה פירוט הגנים שנחשפו 7.2. יצירה של קטלוג פנוטיפי בליזיאנטוס 7.3. בניה של מערכת מחקרית והשבחתית בליזיאנטוס 7.4. חשיבות פרויקט הליזיאנטוס רשימת ספרות Abstract

9 2. רשימת קיצורים. Eustoma exaltatum מין הבר: - Ex. הכלאה מחזירה ל- P1 - BC1P1) הכלאה מחזירה ל- P2. - BC1P2) הכלאה מחזירה שנייה ל- P1. BC2P1) הכלאה מחזירה שנייה ל- P2. BC2P2).chalcone synthase האנזים: CHS.chalcone isomerase האנזים: CHI.flavanone 3-hydroxylas האנזים: F3H.flavonoid 3'-hydroxylase האנזים: F3 H.flavonoid 3,5 -hydroxylase האנזים: F3 5 H 3

10 כ 3. מבוא.3.1 ליזאנטוס, רקע יפעה גדולת פרחים, ליזיאנטוס,,Eustoma grandiflorum הינו פרח קטיף, עציץ וגינון שמקורו בצפון אמריקה. זהו צמח חד/דו-שנתי, דיפלואידי בעל יכולת להפריה עצמית וזרה הפורח באופן טבעי בקיץ. בית הגידול הטבעי שלו מאופיין בצמחיה ערבתית של מדינות המישורים בצפון אמריקה. שמות נפוצים נוספים הינם. 1 Texas Bluebell, Prairie Gentian בסוג Eustoma קיים מין נוסף, E. exaltatum שהינו בר הכלאה עם ליזיאנטוס grandiflorum).e). ב שנה האחרונות הפך הליזיאנטוס מצמח אנונימי יחסית לאחד מעשרת פרחי הקטיף המובילים בשוק. עליה מטאורית זו הינה חסרת תקדים בשוק 1 פרחי הקטיף. נתונים מ Flora Holland מצביעים על היקף מכירות של 37,315,810 וגידול של 8.4% בשנת בלבד. בארץ קיים גידול מתמיד בשטח הגידול של הליזיאנטוס וכיום הוא מונה כ דונם. משך זמן הגידול של הליזאנטוס הוא ארוך יחסית, בין 4 ל- 6 חודשים מזריעה לפריחה. מורפולוגית צמח הבר מאופיינת בחמישה עלי גביע, חמישה עלי כותרת דור יחיד) בצבע כחול-סגול, חמישה אבקנים, שחלה עילית יחידה, צלקת בת שתי אונות ופרי הלקט המכיל זרעים קטנים בכמות רבה - 15,000 זרעים בגרם). הגורם הסביבתי המרכזי המעורב בגדילה ואינדוקציה לפריחה בליזיאנטוס 3 הינו טמפרטורה, טמפ' נמוכה מ- 23 מ"צ דרושה להפרגה ופריצת גבעול פריחה וטמפ' גבוהה יותר תגרום להיווצרות שושנת עלים ללא פריחה או לפריחה מאוחרת. בסביבתו הטבעית, החורף בצורת שושנת עלים. אם הזרעים ינבטו בקיץ, הצמחונים יחשפו לטמפ' גבוהות, לא יפריגו, הצמחים יפרחו בקיץ הבא ומכאן יתנהגו כצמחים דו שנתיים. וישרדו את במידה והזרעים ינבטו באביב הצמחונים יתפתחו תחת טמפ' קרירות והצמחים יפרחו באותה שנה. צמחים אלו 1 יתנהגו כצמחים חד-שנתיים..3.2 לפוטופריודה השפעה משנית על הפריחה. הליזיאנטוס נחשב לצמח יום ארוך פקולטטיבי, לאורך היום יכולה להיות השפעת עיכוב פריחה הבאה לידי ביטוי רק עם דרישות הטמפ' מולאו. יש לציין כי בין זנים מסחריים שונים, קיימת שונות רבה בנוגע להשפעת גורמים סביבתיים 4 אלו. טקסונומיה הליזיאנטוס שייך לסוג,Eustoma למשפחת הערבזיים,,Gentianaceae מסדרת הערבזאים,.Gentianales בכך הוא משתייך לקבוצת ה Euasterid איור 1). קבוצה זו מייצגת למעלה מ- 75,000 צמחים המהווים כרבע מכלל הצמחים הפורחים. הקב' כוללת בתוכה צמחים בעלי חשיבות רבה, כגון: עגבנייה, תפו"א, פלפל, חציל, פטוניה, טבק, קפה, בטטה, זית, סומסום, חמנית, חסה ועוד. מבין הנ"ל הקרוב ביותר לליזיאנטוס הוא הקפה השייך גם כן לסדרת הערבזאים. 4

11 ב המין היחיד הנוסף בסוג מקסיקו, פלורידה, לליזיאנטוס והוא בר הכלאה עימו..E. exaltatum הינו Eustoma 1 לואיזיאנה וטקסס כמו גם באיי הודו המערביים. איור : 1 עץ פילוגנטי המתאר את קב' הEuasterid הנפוץ לאורך אזורי חוף חוליים במפרץ למין זה דמיון מורפולוגי רב טיפוח טיפוח, כללי. המטרה בהשבחת צמחים היא יצירה של זנים חדשים ומשופרים. ניתן לחלק 5 את העקרונות העומדים בבסיס כל תכנית טיפוח לשלושה שלבים עיקריים : איסוף של שונות גנטית המכילה בתוכה תכונות בעלות ערך טיפוחי, שלב זה מכיל בעיקרו הכלאות מיניות. המקור של ההורים יכתיב את מידת השונות שתתקבל וככל שההורים יהיו רחוקים גנטית כך תגדל השונות הפנוטיפית. ניתן לייצר שונות מלאכותית ע"י השריית מוטציות או ע"י טראנספורמציה של גנים ממקורות שונים צמחים טרנסגניים). סלקציה לפרטים המכילים את המופע הטוב ביותר או השילוב הטוב ביותר בתכונות רצויות. יש לשאוף לביצוע הסלקציה בתנאי גידול ספציפיים כדי שיהיה ניתן ללמד ככל הניתן על האפקט הסביבתי הרלוונטי. ייצוב התכונה הרצויה וריבוי. שלב זה כולל מספר שיטות שונות בעלות תלות באופן ריבוי הצמח: א) בגידולים בעלי יכולת להאבקה עצמית ניתן לקבע את התכונות במצב הומוזיגוטי. בגידולים בהם לא מתאפשרת האבקה עצמית מתבצעות הכלאות הדדיות ועקב כך הצאצאים אינם זהים גנטית ואפקט התכונה נמדד מסך האוכלוסייה; Tree of life Project: מכלואים,Hybrid) מבוססים 5

12 ג על הכלאות מכוונות בין שני הורים הומוזיגוטיים ידועים לקבלת צאצאים אחידים גנטית המכילים את התכונות הרצויות; צמחים שמקורם בריבוי קלונאלי cultivar),clonal המכילים את התכונה הרצויה מרובים בצורה וגטטיבית ע"י ייחורים או בתרביות רקמה והם 6 זהים גנטית אחד לשני ובד"כ הטרוזיגוטים בלוקי רבים. על אף ההתקדמות הרבה שנעשתה בשיטות טיפוח מתקדמות כגון סלקציה בעזרת סמנים מולקולאריים selection) Marker-assisted והנדסה גנטית, מרבית עבודת הטיפוח עדיין מבוצעת בשיטות קלאסיות ללא שימוש בכלים מולקולאריים. אחת הסיבות המרכזיות לכך היא העובדה שלחלק נכבד מצמחי התרבות, לא קיים בסיס מולקולארי כלל או שהבסיס אינו גדול מספיק בשביל לאפשר עבודה מולקולארית משמעותית. בנוסף, יש לציין כי יצירה של בסיס טיפוחי קלאסי הינו הכרחי כפלטפורמה עליה נשענת כל עבודת טיפוח מולקולארי. אפיון פנוטיפי קלאסי היה ונשאר אבן היסוד של טיפוח צמחים טיפוח, ליזיאנטוס. זרעי ליזיאנטוס נמכרו בארה"ב בהיקפים קטנים כבר מסוף המאה ה- 19, עם זאת, רק עם הצגת זני המכלוא בתחילת שנות ה- 80 של המאה ה- 20 ע"י חברת הטיפוח היפנית Sakata החל הליזיאנטוס את כניסתו לשוק הפרחים כצמח מוביל. בטווח זמן של שנה הפך הליזיאנטוס מצמח אנונימי יחסית לאחד מעשרת פרחי הקטיף המובילים בשוק. עליה מטאורית זו היא חסרת תקדים בשוק פרחי הקטיף. הדוגמה המובהקת ביותר של פריצה זו היא יפן, בה ב הפך הליזיאנטוס לפרח הקטיף מספר אחת עם היקף מכירות של כ מיליון גבעולים. הסיבות העיקריות להצלחתו: 1. פרחים דמויי ורד 2. חיי מדף מצוינים 3. פרחים כחולים/סגולים. 7 ריבוי הליזיאנטוס נעשה דרך זרעים, עם כי, נמצא שניתן לרבות גם דרך ייחורים ותרביות רקמה. פוטנציאל הריבוי של כל צמח הינו גדול במיוחד עקב כמות הזרעים האדירה בפרי בודד אלפי זרעים בפרי). כיום בשוק יש מבחר הולך וגדל של זנים רובם זני מכלוא. בשלושים השנים האחרונות נעשו עבודות טיפוח רבות שמטרתן העיקרית הינה מאות עד הגדלת המבחר והשוני החיצוני של הפרח. בנוסף, בוצעו עבודות ליצירת פריחה אחידה לאורך השנה, עמידות לטמפ' גבוהות ועמידות למחלות. התקדמות רבה נוצרה בעקבות מעבר ליצור מכלואים ע"י חברת Sakata ב ככל הידוע, הטיפוח המסחרי עד כה, מתבסס על שיטות טיפוח קלאסיות בלבד ואינו נעזר בביולוגיה מולקולארית. מין הבר, הינו בעל צבע כחול-סגול ודור יחיד של עלי כותרת, כיום ישנם זנים בעלי מבחר צבעים: לבן ורוד,קרם, ארגמן, סגול/כחול וצהוב בעלי דור יחיד או מספר דורים. המבחר הפנוטיפי הרחב הקיים כיום בשוק והופעת הפנוטיפים החדשים עם החדרת זני התרבות, מעלים את ההשערה כי במהלך ההשבחה ע"י חברות הזרעים היפניות בתחילת שנות השמונים, בוצעה מוטגנזה המהווה מקור לכל אותם פנוטיפים כגון פרח כפול וצבעים שונים שאינם מופיעים בבר. 6

13 .3.4 עבודות מחקר בליזיאנטוס עקב היות הליזיאנטוס גידול חדש יחסית, קיים מיעוט בעבודות מחקר שפורסמו ורוב המידע מרוכז אצל חברות הזרעים. המחקרים שמפורסמים עוסקים ברובם באספקטים אגרוטכניים יישומיים. תחום נחקר נוסף הוא הצבע והפיגמנטים בפרח. פרסומים ספורים עוסקים באספקטים גנטיים ותורשתיים של הצמח צבע. יחסית למידע המועט הקיים על ליזיאנטוס, קיים מידע נרחב יחסית אודות הפיגמנטים המשפיעים על צבע עלי הכותרת. בליזיאנטוס, צבע הפרח מושפע לרב מאנטוציאנינים 8 Anthocyanin). האנטוציאנינים הם קב' פיגמנטים הידרופילים האחראים לרב הצבע האדום, סגול 9 וכחל בפרחים. אנטוציאנינים מהווים חלק מקבוצת הפלבנואידים Flavonoids) שהינה קבוצה גדולה של מטבוליטים משניים בצמחים. למרות השונות הרבה הקיימת בקבוצת הפלבנואידים, המבנה הבסיסי של המולקולה פשוט וכולל שתי טבעות ארומטיות בעלות 6 פחמנים המחוברות ע"י יחידה בעלת 3 פחמנים איור 2).על בסיס השלד המכיל 15 פחמנים חלים שינויים שונים כגון גליקוזילציה, הידרוקסילציה,אוקסידציה ומתילציה אשר קובעים לאיזו קבוצה ישתייך הפיגמנט ומה יהיה צבעו. קיימים מספר גורמים מלבד הסינטזה הראשונית, היכולים לשנות את מבנהו של האנטוציאנין ובכך לשנות את צבעו: 1) PH בסביבתו של האנטוציאנין בד"כ מוהל הואקואולה); 2) קופיגמנטציה עם פלבנואידים אחרים; לבן, 3) ריכוז הפיגמנט; 4) קשירה של סוכרים שונים המשפיעה על יציבות המולקולה; 5) קשירה של המולקולה למתכות שונות. הליזיאנטוס מתאפיין במספר צבעים עיקריים: סגול, ורוד וארגמן. בנוסף קיימים גוונים חלשים של צהוב, וקרם. ירוק Markhem 1993), מצאו כי בכל הליזיאנטוס הצבעוניים וחוברו 11,10 קיימים אותם פיגמנטים מבחינה איכותית. עם זאת, 10 ריכוזים שונים של אנטוציאנינים בעלי הכותרת הם הגורם המרכזי בקביעת הצבע : שני גליקוזידים עיקריים של פלרגונידין pelargonidin) ;cyanidin) בזני הארגמן מלווים בכמות קטנה של בזנים הורודים ציאנידין שני גליקוזידים עיקריים של ציאנידין מלווים בכמות קטנה של פלרגונידין ודלפנידין; בזנים הסגולים גליקוזיד דלפנידין delphinidin) עיקרי ושני סוגי דלפנידין מישניים מלווים בכמויות קטנות של 2 סוגי ציאנידין; בזנים הלבנים, אין אנטוציאנינים. ההבדל בין 12 גווני לבן שונים נגרם מריכוז פלאבנואידים שונה. על אף פי שנהוג להניח כי ברמה התאית, האנטוציאנינים נצברים בואקואולה. בליזיאנטוס נמצא כי 30% מסה"כ הפלבנואידים בתא אפידרמיס של עלה כותרת נצברים בדופן התא, 14% נצברים 12 בציטופלסמה ואילו בואקואולה 56% הנותרים. לממצא זה שני אספקטים הנוגעים לצבע הפרח א. 10 ידוע כי לאינטראקציה בין פלבנואידים השפעה מכרעת על הצבע. מידור פלבנואידים שונים באזורים שונים, מהווה פקטור המשפיע על צבע עלי הכותרת. מצברים של פלבנואידים חסרי צבע, 12 הנאגרים בציטופלסמה. ב. נמצא כי צבע צהוב בליזיאנטוס יכול לנבוע 7

14 cdna באורך מלא, של מספר גנים מרכזיים בביוסינטזה של הפלבנואידים, נחקרו ואופיינו 11 בליזיאנטוס. מבדיקה של 7 זנים בעלי צבע שונה, נמצא, כי בזן בעל צבע לבן אין ביטוי לגן flavonoid - 5, 3 ואילו בשני זנים ורודים לא נצפה שום ביטוי לגן chalcone synthase CHS) F3 5 H) hydroxylase איור 2). בזנים הסגולים 4 במספר) על אף הבדלי גוונים לא נצפה שום חסר בביטוי הגנים שנבדקו. יש לציין שהבדיקות נערכו על זנים מסחריים שהם ככל הנראה מכלואים ושלא נבדקה שום תורשתיות בביטוי הגנים. איור 2: מסלול סינטזת אנטוציאנינים גנטיקה. מעט עבודות עוסקות בהורשת תכונות בליזיאנטוס. באף אחת מהן אין שילוב של מידע מולקולארי עם מנגנוני הורשה. 13,4 בשני ניסויים שונים נרשמו מספר עדויות לאון-כילאיים Heterosis) חיובי בקצב גדילה, גודל עלה, קוטר גבעול ומספר פרקים. בבדיקת מנגנון ההורשה של 14 תרדמת זרעים בליזיאנטוס, הציעו אקר וחוברו, מנגנון גנטי הכולל 6 אתרים דיאללים בעלי אפקט מצטבר. נוכחות של לפחות 9 אללים דרושה ליצירת פנוטיפ ברור של תרדמת זרעים. המנגנון פוענח מאוכלוסיה הכוללת קווי F2 F1, וBC1 שבבסיסם הכלאה בין קו טיפוח הדורש קור לנביטה לקו 8

15 .3.5 אדיש לקור בנביטה. באותה מערכת ניסוי, נמצא כי קיים אפקט אדטיבי דומיננטי לגנים המעורבים 15 במהירות הנביטה. עם זאת, האפקט נרשם רק בזרעים שקוררו. ככל הנראה קיימת השפעה פליאוטרופית של תרדמת הזרעים על מהירות נביטתם. רציפרוקליות, יש לציין, לא נרשמה כל עדות להשפעת הורשה אימהית בניסויים אלו. 15 במקרים רבים כי קיימת השפעה אימהית או ציטופלסמטית על מהירות נביטה. תורשה של צבע פרח כי על אף שנבדקה ע"י הכלאות וזאת, על אף הידוע תורשה של צבע פרח ככלל והגנטיקה של אנטוציאנינים בפרט נחקרת כבר זמן רב. מאז ימי מנדל שבחן את הורשת הצבע באפונה sativum) Pisum ועד ימינו, בוצעה עבודה גנטית וביוכימית נרחבת להבנת המנגנונים השונים המשפיעים על צבע הפרח. לימוד תפקידם של גנים שונים המשפיעים על סינטזת האנטוציאנינים הינה נוחה יחסית משני סיבות עיקריות; 1) קיום של פנוטיפ ברור במוטציה בודדת ברב 16 המקרים; 2) מוטציות ובעיות בתפקוד של הגנים אינה גוררת בעיה בתפקודו הכללי של הצמח. כיום יש הבנה נרחבת יחסית של המנגנונים הקשורים בסינטזת אנטוציאנינים ובמספר אורגניזמים זוהו ובודדו 16 רבים מהגנים המעורבים. פטוניה hybrida),petunia גם כן מקב' ה- Euasterid היא אחד משלושת האורגניזמים בהם בוצע המחקר המקיף ביותר על הגנטיקה שבבסיס הביוסינטזה של האנטוציאנינים 16 בנוסף לתירס ולוע-הארי). בפטוניה נמצא כי לפחות 35 גנים מעורבים בקביעת צבע הפרח. בין השאר נמצאו כ 12 עותקים שונים המקודדים לCHS, כאשר רק הגן ChsA משועתק באופן משמעותי ברקמת 17 הפרח. גן זה הוא חלק ממספר מצומצם של גנים בנוסף ל- CHI ו- F3H בפטוניה) שנמצא כי הם בעלי תבנית ביטוי שונה משאר הגנים האחראים על סינטזת אנטוציאנים. גנים אלו הוגדרו כ early ) EBGs 18 biosynthetic genes. הגנים האחרים, בעלי הביטוי המאוחר יותר בשלבי התפתחות הפרח, הוגדרו כ.late biosynthetic genes) LBGs בין גנים אלו, בודדו בין השאר הגנים; Ht1, Ht2 האחראים על קידוד האנזים F3 H) Flavonoid 3 -hydroxylase הדרוש ליצירת ציאנידין גוונים אדומים); Hf1, Hf2 האחראים על קידוד האנזים F3 5 H) flavonoid 3,5 -hydroxylase הדרוש ליצירת דלפנידין 18 גוונים סגולים/כחולים), הגן Hf1 מראה דומיננטית מלאה ביצירת הפיגמנט בניגוד לHf2. הכלאה שבוצעה בין צמח אדום הומיזיגוט לבין צמח סגול הומוזיגוט הוכיחה כי לצמחים הסגולים צבע דומיננטי הבא לידי ביטוי ע"י האלל הדומיננטי של הגן Hf1 19. הגנים המתוארים, הם רק מספר גני מפתח במנגנון הגנטי המסובך המשפיע על צבע הפרח דרך השפעה על תכולת האנטוציאנינים. מלבד הגנים הרבים המשפיעים באופן ישיר על סינטזת הפיגמנטים והרכבם, קיימים גנים נוספים, המשפיעים באופן עקיף, על סינטזת הפיגמנטים ובאופן ישיר, על צבע הפרח. דוגמה מובהקת לכך היא הגנים Ph1 ו- Ph2 שהשפעתם 19 על ה- ph של הואקואולה גורמת להבדלי צבע בפטוניה. אספקט מעורר עניין בנושא זה היא העובדה שבפטוניה הובחנה תאחיזה בין גנים המשפיעים על תכולת האנטוציאנים Hf) לגנים המשפיעים על 19 החומציות הואקואולה Ph). 9

16 .3.6 תכונות כמותיות מורכבות מרבית מהתכונות החשובות לאון הצימוח ולערכם החקלאי של צמחים הן תכונות כמותיות מורכבות. כלומר, תכונות המושפעות מהרבה גנים, סביבת הגידול והאינטראקציה בין הגנים ובין סביבות הגידול 20 השונות. מיפוי אתרים לתכונות כמותיות Loci-QTL) Quantitative Traits הוא כלי מפתח המקל את למידת הארכיטקטורה הגנטית. כלומר, את המיקום והמספר של הגנים בגנום שמשפיעים על תכונה 20 מסוימת והיחסים ביניהם. באספקט החקלאי, זהו כלי בעל חשיבות גדולה, הוא מאפשר הפרדה בין האפקט הגנטי לאפקט הסביבתי ובכך מייעל את כווני ההכלאה על מנת להגדיל את המרכיב הגנטי ללא 21 השפעת האפקט הסביבתי. על מנת לאפשר מיפוי של תכונות אלו, יש צורך באיסוף מידע פנוטיפי וגנטי נרחב ומדויק ככל הניתן. יצירה של קטלוג פנוטיפי הינה שלב ראשון בדרך למיפוי גנטי ואיתור.QTL לאחר איסוף מידע פנוטיפי וגנטי,.3.7 צריך לבצע אינטגרציה וניתוח סטטיסטי על מנת להגיע למסקנות מדויקות. כיום, קיים קושי ביואנפורמטי להכיל מידע מפורט על שונות פנוטיפית שמתפלגת באופן רציף 22 באוכלוסייה מתפצלת בתוך מאגר מידע גנומי.."Phenom Networks" לאחרונה, פתוחים טכנולוגים בתחום הביואינפורמטיקה העשירו במידה רבה את יכולתנו לתאר מבנים 23 ביולוגים מורכבים. אנליזה של בסיסי מידע גדולים על תכונות פנוטיפיות, גנוטיפיות וסביבתיות ליצירת רשת של קורלציות בין תכונות חשפה באדם כמו גם בעגבנייה, הקשרים בין פנוטיפים שונים של האורגניזם השלם והביאה למציאתם של גני מפתח בתהליכים ביולוגים מרכזיים. לאחרונה פותחה הפלטפורמה הביואינפורמטית Networks" "Phenom ע"י ד"ר יניב סמל מהפקולטה לחקלאות באוניברסיטה העברית. הפלטפורמה מאפשרת להתמודד עם כמות גדולה של נתונים פנוטיפים, גנוטיפים וסביבתיים ומאפשרת ניתוחים סטטיסטים שונים על נתונים מאוכלוסייה מתפצלת. שימוש בפלטפורמה Networks" "Phenom לניתוח המידע הגנוטיפי והפנוטיפי שמתקבל על הליזיאנטוס יהווה כלי טיפוחי חשוב לליזיאנטוס כמו גם משוב חשוב להמשך פיתוחה של המערכת הביואינפורמטית..3.8 ליזיאנטוס בישראל הליזיאנטוס מגודל בהיקפים גדלים מדי שנה כאשר יתרונו של המגדל הישראלי מצוי בעונת השיווק החורפית כמו גם בזנים בעלי מספר הדורים. אזור היצור העיקרי הוא הבשור אך הפרח מגודל גם בערבה, בחבל לכיש, בשרון ועוד. בין השנים 2000 ו 2004 כמות יצוא הפרחים מישראל להולנד הכפילה את עצמה. בהתאם לנתון זה, בשנים אלו גדל גם חלקה היחסי של ישראל בהספקה לבורסה; מ 15% ב 2000 ל 27% ב חלקם של הפרחים המלאים מספר דורים של עלי כותרת) בסך כל הפרחים גדל בשנים אלו מ 34% מגדלים רבים. ל 76%. עקב קריסתו של ענף הורדים בארץ, משמש הליזיאנטוס כגידול תחליפי עבור 10

17 ג ב א 4. מטרות המחקר עבודה זו הינה עבודה ראשונית המתמקדת במחקר גנטי וטיפוחי בליזיאנטוס. העבודה תיצור בסיס גנטי מגוון להמשך המחקר באורגניזם. בניית מערכת מחקר וטיפוח בליזיאנטוס. פיתוח שיטות ופרוטוקולים אגרוטכניים ומחקריים כמו גם בנייה וייצוב של תשתית גנטית רחבה הכוללת מערכת של אוכלוסיות הומוזיגוטיות ואוכלוסיות מתפצלות ליצירה של בסיס מחקרי עשיר. אפיון מספר תכונות פנוטיפיות בעלות חשיבות טיפוחית בליזיאנטוס. התמקדות במספר תכונות איכותיות-בדידות בעלות חשיבות טיפוחית ובחינת מנגנון ההורשה שלהן. בניית קטלוג פנוטיפי רחב לצמח הליזיאנטוס. יצירה של קטלוג פנוטיפי הכולל בתוכו עשרות מאפיינים פנוטיפים על בסיס אוכלוסיות בין מיניות מתפצלות. ליצירה של בסיס פנוטיפי רחב שישמש בעתיד לאפיון תכונות כמותיות ובנייה של מפה גנטית בליזיאנטוס. 11

18 שיטות וחומרים 5.1. חומר צמחי ליזיאנטוס,.Eustoma grandiflorum 1. זני תרבות, במהלך השנים גודלו כ 31 זנים מסחריים של חמש חברות מובילות. במרוצת הזמן בוצע על זנים אלו הליך של הפריות עצמיות וזרות על מנת לקבע ולאפיין תכונות צמח חשובות. כיום קיימים במעבדה כ 470 קווי סלקציה שונים ברמות קיבוע משתנות. זרעים של מין הבר.2 קווי בר. בשנת 2006 נקנו מחברת Seed Native American 25.item # 3061 E.grandiflorum בצמחים שגודלו מזרעים אלו נרשמה שונות רבה בצורת הפרח והצמח כמו גם באופי הצימוח ומועד הפריחה. עם זאת, לכל הפרחים היה דור אחד של עלי כותרת וצבע סגול. לפיכך, התייחסנו לצמחים אלו כאל תוצרי הפריה זרה הטרוזיגוטיים והמשכנו לאורך השנים בקיבוע קווים שונים מתוכם. כיום קיימים כ 10 קווים ברמת קיבוע מתקדמת F5). בנוסף, בוצעו מספר רב של הכלאות עם קווי התרבות על מנת לאפיין ולייבא תכונות חשובות מן הבר. 25 Native American Seed בשנת 2006 נקנו מחברת.Eustoma exaltatum זרעים של מין הבר.E. exaltatum הצמחים הראו אחידות רבה מכל בחינה נראית לעין. לפיכך, התייחסנו לצמחים אלו כאל תוצרי הפריה עצמית הומוזיגוטיים. כל הצמחים היו בעלי דור יחיד, סגולים. קו זה שימש בסיס לבניית אוכלוסיית המחקר הגנטי. בנוסף בוצעו מספר רב של הכלאות עם קווי התרבות על מנת לאפיין ולייבא תכונות חשובות ממין הבר עונות גידול קיץ :2006 זריעה 22/2/06, שתילה,30/4/06 התחלת פריחה,26/6/06 סיום קטיף פירות 17/10/06. הצמחים נשתלו בחווה של הפקולטה לחקלאות ברחובות בשדה הפתוח. שטח הגידול היה כשלושה דונם בעומד שתילה של 25 צמחים במטר שורה. כחודש לפני השתילה בוצע חיטוי קרקע ע"י מטיל ברומיד, מלבד זאת לא בוצעו כל טיפולי הגנת הצומח. לא בוצעה כל הדליה לצמחים. השקיה בוצעה בטפטוף בלבד, בחודש הראשון ניתנו שלוש השקיות ביום של שני קוב לדונם כל אחת, לאחר מכן ועד תחילת אוגוסט ניתנו שתי השקיות של שני קוב לדונם ביום. מתחילת אוגוסט ועד סיום העונה הורדה כמות המים באופן הדרגתי עד להשקיה אחת ביומיים של קוב לדונם קיץ :2007 זריעה 9/1/07, שתילה,28/3/07 התחלת פריחה,10/6/07 סיום קטיף פירות 23/9/07. הצמחים נשתלו בחווה של הפקולטה לחקלאות ברחובות בשדה הפתוח. שטח 12

19 הגידול היה כשלוש דונם בעומד שתילה של 25 צמחים במטר שורה. לא בוצעו כל טיפולי הגנת הצומח. לא בוצעה כל הדליה לצמחים. השקיה ודישון ניתנו באופן זהה לעונת קיץ 06 מלבד תוספת של השקיה בהמטרה, שני קוב לדונם פעמיים ביום בשלושת השבועות הראשונים מהשתילה אביב 2008: זריעה 17/10/07, שתילה 17/1/08. השתילים נזרעו בשני מבנים שונים: חממה מחוממת בעלת גג זכוכית ובית רשת מכוסה ניילון ללא חימום. שני המבנים ממוקמים בחווה של הפקולטה לחקלאות ברחובות. 1. חממה מחוממת. התחלת פריחה 16/4/08, סיום קטיף פירות 20/7/08. שטח הגידול היה כ 36 מ"ר. הצמחים נשתלו בעומד של 50 שתילים למטר שורה. כחודש לפני שתילה בוצע חיטוי קרקע ע"י מטיל ברומיד, מלבד זאת לא בוצעו כל טיפולי הגנת הצומח. לצמחים בוצעה הדליה בעזרת רשת הדליה ומוטות ברזל. השקיה בוצעה בטפטוף בלבד, בחודש הראשון ניתנו שלוש קוב לדונם שלוש פעמים ביום, לאחר מכן ועד התחלת הפריחה ניתן שני קוב לדונם פעמיים ביום. מהתחלת הפריחה ועד לסיום העונה ניתנו קוב לדונם פעמיים ביום. 2. בית רשת, פריחה 4/5/08, סיום קטיף פירות 27/8/08. שטח הגידול היה כרבע דונם. הצמחים נשתלו בשתי עומדים שונים: קווים שאופיינו פנוטיפית באופן נרחב ראה תכונות כמותיות, עונה 2008) נשתלו 10 צמחים למטר שורה. שאר הקווים נשתלו בעומד של 50 צמחים למטר שורה. כחודש לפני שתילה בוצע חיטוי קרקע ע"י מתיל ברומיד בנוסף בוצעו מספר טיפולים נקודתיים לאחר אפיון נגיעות במחלות פיטריתיות שונות בחודשיים הראשונים לגידול. החומרים ששימשו לטיפולים הינם: מנצידן, רידומיל, סוויץ, רוברל ודיינון. יישום החומרים והריכוזים ניתן בהתאם להתוויות. השקיה ודישון ניתנו באופן זהה לטיפול בחממה המחוממת באופן יחסי לשטח הגידול). כיסוי הניילון הורד מבית הרשת ב 22/4/ אביב 2009: זריעה 24/9/08, שתילה 19/1/09. השתילים נזרעו בשלושה מבנים שונים: חממה מחוממת בעלת גג זכוכית, בית רשת מכוסה ניילון ללא חימום וחממת פלסטיק בעלת וילונות רשת ומאוורר. שלושת המבנים ממוקמים בחווה של הפקולטה לחקלאות ברחובות. 1. חממה מחוממת. חממה זהה לחממה מ התחלת פריחה 13/4/09. שטח הגידול היה כ 100 מ"ר בעומד של 42 צמחים למטר שורה. כל שאר תנאי הגידול הנם זהים לתנאי הגידול בחממה המחוממת ב בית רשת. אותו בית רשת מ התחלת פריחה 26/4/09. עומד של 42 צמחים למטר שורה. גג הפלסטיק הורד ב 19/5/09. כל שאר תנאי הגידול זהים לתנאי בית הרשת בעונה חממת פלסטיק ללא חימום, הצמחים גודלו במצע מנותק "אודם 93" 2/3 טוף, 1/3 כבול) של "טוף מרום גולן" בדליים של שמונה ליטר. חמישה צמחים בדלי. גודל החממה 13

20 כ 150 מ"ר. התחלת פריחה 13/4/09. השקיה ודשן נתנו בטפטוף בלבד בכמויות זהות לכמויות בבית הרשת באופן יחסי לשטח הגידול). בניית אוכלוסיות מחקר גנטיות איור 3). 1. עונה 2006, בוצעו הכלאות בין.E exaltatum E.grandiflorum ליצירת 40 קווי F1 בין מיניים..2 ל 40 קווי טיפוח שונים של עונה 2007, נבחרו 2 קווים בין מיניים להמשך בניית אוכלוסיות גנטיות בין מיניות. ההורים התרבותיים של הקווים שנבחרו הראו קיבוע למספר דורים, לצבע ולאופי צימוח. הקווים הינם תמונה 1): White קו בכיר יחסית, מקובע לצבע לבן ומספר רב של דורים עם אופי צימוח הכולל פריצות ענפים מהאזור האמצעי של הענף המרכזי ופרקים ארוכים. Pink קו מקובע לצבע ורוד ודור יחיד עם אופי צימוח הכולל פריצות ענפים מהאזור התחתון של הענף המרכזי, ומספר רב של פקעי פריחה. פרקים קצרים.5.3 תמונה 1 קווי הורים, אוכלוסיות מחקר. -1 exaltatum,e. 2 הורה ורוד,,Pink -3 הורה לבן,.White בקווים שנבחרו בוצעו האבקות עצמיות ליצירת קווי F2 והכלאות מחזירות BC) לשני ההורים. בנוסף בוצעו הפריות עצמיות לקווי ההורים להמשך ריבוי וקיבוע. 3. עונה 2008, גודלו צמחי ה F2 וBC1 לשני הכיוונים בשני האוכלוסיות White) וPink ) כמו גם קווי ההורים וקווי הF1. בכל הקווים תועד אפיון פנוטיפי נרחב ראה סעיף - אפיון פנוטיפי). לכל הצמחים בעונה בוצעה הפריה עצמית ליצירת F3 ו BC1F1 כמו גם הכלאה מחזירה לקווי ההורים התרבותיים. 4. עונה 2009, גודלו כל צמחי ההפריות העצמיות מעונה כמו גם כל ההכלאות המחזירות לקווי התרבות. 14

21 איור 3 בניית אוכלוסייה מחקר גנטית -BcEx הכלאה מחזירה ל BcP..E, exaltatum הכלאה מחזירה להורה הורוד, BcW הכלאה מחזירה להורה הלבן. 06_s254 White) BcWhite E.exaltatum F1 F1 F2 BcEx BcEx F2 06_227.3 pink) BcPink 2009 self BcW self BcW self BcW self BcP self BcP self BcP 5.4. ייצור שתילים 1. זריעה: כל הזריעות בוצעו בסניף נחלים של משתלת "חישתיל" ע"י חברי המעבדה. הזרעים נזרעו במגשי 390 סטנדרטים לגידול ליזיאנטוס. 2. גידול שתילים: כל השתילים גודלו במשתלת "חישתיל" בנחלים באופן זהה לגידול מסחרי של שתילי ליזיאנטוס. 3. דילולים: לאחר יום מזריעה בוצע דילול שתילים במגש ע"י חברי המעבדה. הדילול בוצע תוך שימוש במלקטים עד לנבט בודד בכל תא במגש האבקות עצמיות. האבקות עצמיות בוצעו בשני שלבים: 1. כיוס בשקית נייר של פרח משלב 3, התחלת צבירת צבע והתנפחות הפקע ראה שלבי התפתחות הפרח), ועד שלב 6, פרח פתוח, אבקנים פרוקים, צלקת סגורה. 2. לאחר כ 5-14 יום מכיוס נפתחה השקית והצמח הואובק ידנית. האבקה הועברה בעזרת מלקט מאבקניו של הפרח המכויס או ע"י הצמדת אבקנים של פרח אחר מאותו הצמח לצלקות של הפרח המכויס. לאחר האבקה נסגר הצמח בחזרה בשקית. 15

22 לזרעים שנוצרו מהפריה לא ידנית התייחסתי כאל זרעים שההורה הזכרי שלהם אינו ידוע זרות, האבקות זרות בוצעו בשני שלבים: 1. פרחים בשלב 3 התחלת צבירת צבע והתנפחות הפקע) נפתחו ידנית וסורסו ע"י תלישת האבקנים ידנית או בעזרת פינצטה). לאחר הסירוס הפרחים כויסו בשקית נייר. 2. לאחר כ 7-14 יום מכיוס נפתחה השקית והצמח הואובק ידנית. האבקה בוצעה או ע"י הצמדת המאבק של פרח מההורה הזכרי לצלקת של הפרח המכויס או תוך שימוש במכחול מחוטא באתנול 70% ובאבקה הנדרשת. איסוף פירות וזרעים לאחר יום מהאבקה נקטפו הפירות לתוך שקיות נייר. הפירות יובשו בתוך שקיות הנייר באינקובאטור הכולל מפוח ב 37 c עד ייבוש מלא. הזרעים אוחסנו בטמפ' של ±20 c עד לזריעה אפיון פנוטיפי האפיון והניתוח הפנוטיפי נחלק לשני חלקים עיקרים: בדיקת תכונות איכותיות- בדידות. אלו הן שלוש תכונות חשובות הקשורות לצבע הפרח ולדורים להן קיים מנגנון גנטי משוער של גן אחד או שניים. בדיקת התכונות האיכותיות בוצעה על מספר משפחות מתפצלות באוכלוסיות הסלקציה בעונות כמו גם על אוכלוסיות המחקר הגנטי בעונות 2008/9. הבדיקה בוצעה ע"י מיון לתכונות השונות וספירה של כמות הצמחים המראה כל תכונה בתא המשפחתי..1 תצורת הצבעים בפרח,.Configuration.2 מתאר את סידור הצבעים על גבי עלי הכותרת. אובחנו שלוש דוגמאות עיקריות: 1- עלה כותרת בעל צבע אחיד, 2- עלה כותרת בעל שני צבעים דו-צבע,,Picotee 3- שמפניה תמונה 2). צבע עלי כותרת,.Petal adaxial top color הובחנו שלושה צבעים מרכזיים: 1- סגול, 2- ורוד, 3- לבן תמונה 3)..3 דורים של עלי כותרת, petals).whorl נחלק לשני סוגים עיקריים: דור יחיד פרח בעל חמישה עלי כותרת היוצרים מעגל בודד של עלי כותרת המקיפים את אברי הרבייה, פרח מלא פרח בעל שני מעגלים או יותר של עלי כותרת תמונה 4). 16

23 תמונה 4 דורים של עלי כותרת. 1- דור יחיד, 2- פרח מלא. תמונה 3 צבע עלי כותרת. 1 סגול, 2 ורוד, -3 לבן. תמונה 2 קונפיגורצית הצבעים בפרח. 1- עלה כותרת בעל צבע אחיד, 2- עלה כותרת בעל שני צבעים דו-צבע,,Picotee -3 שמפניה יצירה של קטלוג פנוטיפי רחב לתכונות כמותיות ובדידות. התכונות נבדקו בעונות 2008/9 על הצמחים באוכלוסיות המחקר הגנטי. על מנת ליצור אחידות בקריאות פנוטיפיות שונות, יש צורך בהגדרת שפה משותפת של מספר מושגים: 1) שלבי התפתחות הפרח. על מנת למדוד נתונים שונים הקשורים בפרח הוגדרו 9 שלבי התפתחות תמונה 5): 1. פקע סגור עלי גביע גבוהים מעלי כותרת. 2. התחלת פתיחת פקע עלי גביע ועלי כותרת באותו הגובה. 3. פקע פתוח עלי כותרת גבוהים מעלי גביע, פקע נפוח. 4. התחלת פתיחת פרח עלי כותרת מראים התחלת פתיחה, אבקנים וצלקת סגורים. תמונה 5 שלבי התפתחות הפרח 1-9). 17

24 א פתיחת פרח עלי כותרת פתוחים, אבקנים וצלקת סגורים. 5. פתיחת אבקנים עלי כותרת פתוחים ואבקנים פתוחים, צלקת סגורה. 6. אנטזיס צלקת ואבקנים פתוחים. 7. כמישה עלי כותרת מהוהים ומתחילים להסגר. 8. סוף פריחה עלי כותרת מאבדים טורגור. 9. 2) הגדרת "ענף", רק ענפים בעלי שני זוגות עלים או יותר הוגדרו כענפים. 3) הגדרת "פקע פריחה", רק פקעי הפריחה שפרצו מחיק עלים חפים ואורכם גדול מ 1 ס"מ הוגדרו כפקעי פריחה. סה"כ נלקחו כ 86 מדדים שונים המתוארים בקטלוג הפנוטיפי המובא להלן. הקטלוג בנוי מ 13 קטגוריות אשר מחולקות ל 4 קבוצות עיקריות: 1) מדדי צמיחה והתפתחות; 2) מדדי אנטומיה ומורפולוגיה; 3) מדדי יבול; 4) מדדי פריון. 1. מדדי צמיחה והתפתחות אופיינו ע"י 8 קטגוריות המכילות סה"כ 38 מדדים. הקבוצה מתארת את התפתחות הצמח לאורך גידולו כמו גם את ארכיטקטורת הצימוח ויבול הפרחים שלו. המדדים אופיינו על גבי הצמחים בחממה ובבית הרשת בשני בזמנים שונים: 1) בפעם אחת ביום מסוים לכל הצמחים; 2) ביום בו הפרח הראשון הגיע לשלב התפתחות 6. מספר מדדים נלקחו במספר זמנים שונים. האפיון בוצע ע"י מדידות כמותיות כמו גם ע"י הערכה איכותית ע"פ סיווגים שנקבעו מראש. 2. מדדי אנטומיה ומורפולוגיה אופיינו ע"י 4 קטגוריות שונות המכילות סה"כ 43 מדדים. המדדים, בעלי תלות מזערית בהתפתחות הצמח, מתארים את מורפולוגית הצמח, הפרח והפרי. איסוף הנתונים על הפרח התרכז בפרח השלישי שפרח בצמח, בשלב התפתחות 7. שאר המדדים נלקחו באופן אחיד, בזמן אחיד לכל הצמחים. 3. מדדי פריון אופיינו ע"י 3 קטגוריות המכילות 5 מדדים. המדדים מתייחסים לעקרות זיכרית, ייצור הזרעים בפירות ונביטת הזרעים. מדדי צמיחה והתפתחות: 1. ימים לפריחה: איפיון זה מתאר פרק זמן בימים עד לשלב מוגדר בהתפתחות הצמח. ימים לפרח ראשון,.First flower מספר ימים מזריעה לפרח ראשון בשלב 6 שחרור אבקה, צלקת סגורה). הוגדר כזמן פריחה תמונה 6). 18 תמונה 6 שלבי פנוטיפ. 1 -פרח ראשון, 2- פרח שלישי.

25 ב ג ד א ב ג ד ו ה ימים לפרח שלישי,.Third flower מספר ימים מזריעה לפרח השלישי בשלב 7 אנטזיס). הוגדר כ"זמן פרח שלישי" תמונה 6). מספר ימים בין פרח ראשון לשלישי, פריחה" ל"זמן פרח שלישי"..FiToTh מספר הימים שעברו מ"זמן זמן פרח,.Flower time מספר הימים, ללא קטיף, משלב 6 בהתפתחות פרח ועד לשלב 9. נמדד על הפרח הראשון שפרח בצמח..2 התפתחות: בקטגוריה זאת נכללות מדידות שונות המאפיינות את און הצימוח והתפתחות איברים ספציפיים המקרינים על התפתחות הצמח. כל המדידות בוצעו בבית הגידול של הצמחים. כל האורכים מדודים בס"מ. גובה הצמח,.Plant height נבדק מהקרקע עד לנקודה בגבוהה ביותר בצמח. נבדק בזמן פריחה ו 174 יום מזריעה תמונה 7). אורך ענף..Branch height אורכו של הענף המשני הגבוהה בצמח. פרק, אורך.internode length המרכזי. נבדק בזמן פריחה ו 190 יום מזריעה תמונה 7). קוטר גבעול,.Stem diameter אורכו של הפרק החמישי מהקרקע בגבעול קוטרו של המרכזי. נבדק בזמן פריחה ו 190 יום מזריעה תמונה 7). הפרק החמישי מהקרקע בגבעול גודל צאצאים ממוצע,.Av.offspring size ניתן ציון על סמך התבוננות מ 1-4 לגודל הצמח. 1 צמח מנוון במצב שושנת, 2- צמח עם ענף פריחה מרכזי בלבד, 3- ענף פריחה עם מספר בודד של פריצות ענפים משניים 4- צמח גדול עם ענפים רבים. זן מסחרי שימש כביקורת. המדד נלקח 160 יום מזריעה תמונה 8). מיקום הפרח הראשון,.FNMS הובחן כי בצמחים מסוימים הפרח הראשון שפורח אינו מצוי על הגבעול המרכזי. 0 הפרח הראשון פורח על הענף הראשי. 1 הפרח הראשון לא על הענף הראשי. תמונה 8 דוגמא לגודל צאצאים ממוצע דוגמא מייצגת לגודל צאצאים ממוצע 1-4. * התמונה נלקחה בשלב התפתחותי מאוחר יותר מהשלב בו נלקח הפנוטיפ. 19 תמונה 7 מדידות צמח. 1- גובה צמח, 2- גובה פרק, 3- קוטר גבעול.

26 א ב ג ד ה ו 3. מספר פרקים: נספרו פרקים באזורי צמח שונים. מספר הפרקים משקף את מספר העלים כיוון שלכל פרק שני עלים בבסיסו. בנוסף, מספר הפרקים משקף גם את פוטנציאל פריצות הענפים כיוון שבד"כ, בליזיאנטוס פורץ ענף בודד מחיק עלה. מספר הפרקים על הגבעול המרכזי,.#internode main נבדק 189 יום מזריעה איור 2.4). מספר פרקים לפרח,.#Max internode main מספר הפרקים עד לפרח בענף המרכזי. שווה ערך לחצי ממספר העלים לפרח איור 2.4). מספר פרקים על ענפים,.#internode branch מספר הפרקים על כל הענפים היוצאים מהגבעול המרכזי לא כולל ענפים הפורצים מהקרקע. ו 189 יום מזריעה איור 2.1 ). פרקים מהקרקע, נבדק בזמן פריחה internode.#graund מספר כל הפרקים על כל הענפים הפורצים מהקרקע לא כולל הגבעול המרכזי. נבדק בזמן פריחה איור 2.2). סה"כ מספר פרקים בענפים,.Total internode branch מספר כל הפרקים בצמח מלבד הפרקים על הגבעול המרכזי. נבדק בזמן פריחה איור 2.3). סה"כ פרקים,.Total internode מספר כל הפרקים על כל הצמח. נבדק בזמן פריחה ו 189 יום מזריעה איור 2.5). איור 2 מספר פרקים. 1- מספר פרקים על ענפים 16), 2- מספר פרקים מהקרקע 5), 3- סה"כ מספר פרקים מענפים 21), 4- מספר פרקים על הגבעול המרכזי=מספר פרקים לפרח 6), 5- סה"כ פרקים 27). 20

27 א ג ב ה ד 4. ענפים: בקטגוריה נכללים מספרי ענפים הפורצים מאזורים שונים בצמח, כמו גם מיקום הפריצות על גבי הצמח. מיקום ומספר הענפים משקף את און הצימוח וארכיטקטורת הצמח. נקודות פריצה,.Branch points צוינו מספרי הפרקים על הגבעול הראשי מהם יוצאים ענפים. נבדק 182 יום מזריעה איור 3). נק' פריצת ענף ראשונה,.First branch point הפרק הנמוך ביותר בצמח ממנו פורץ ענף, במידה והענף הראשון פורץ מהקרקע נרשם 0. נבדק לאחר 318 יום מזריעה איור 3). ענפים מהגבעול המרכזי, המרכזי. נבדק בזמן פריחה.#branch main איור 4.1). מספר פריצות של ענפים מהגבעול ענפים מהקרקע,.#branch ground מספר פריצות ענפים מהקרקע. נספרו רק ענפים בעלי שתי זוגות עלים או יותר. נבדק בזמן פריחה איור 4.2). סה"כ ענפים,.Total branch מספר הענפים שפרצו מהגבעול המרכזי ומהקרקע. נספרו רק ענפים בעלי שתי זוגות עלים או יותר. נבדק בזמן פריחה ו 182 יום מזריעה איור 4.3). איור 4- מספר ענפים. 1- ענפים מהגבעול המרכזי 4), 2- ענפים מהקרקע 2), 3- סה"כ ענפים 5)..3,5,6 איור 3 נקודות פריצה הנקודות מהם פורצים ענפים: נק' פריצת ענף ראשונה: 3. 21

28 ב א ב ז ג ד ו א ה.5 נגזרות התפתחות: אלו הם מדדים שונים הגזורים ממדידות ההתפתחות השונות והם מתארים את צורת הצמח והצימוח באופן יחסי לגודלו. אינדקס פקע פרק,.BudNode index אינדקס נגזר המתאר נדבך מארכיטקטורת הצמח. נוצר מחלוקת "סה"כ פקעי פריחה" ראה מדדי יבול) ב"סה"כ פרקים". נותח על פי המדדים שנלקחו ביום פריחה. אינדקס עלים,.Leaf index אינדקס נגזר המתאר את הנטייה של הצמח ליצירת נוצר מחלוקת עלים. "סה"כ הפרקים" שווה ערך לחצי מכמות העלים) הצמח". נותח על פי המדדים שנלקחו ביום פריחה. אינדקס שילטון קודקודי,.A.dom index ב"גובה אינדקס נגזר המתאר את עוצמת השלטון הקודקודי ע"י חלוקה של "סה"כ הענפים" ב"מספר פרקים לפרח". על פי המדדים שנלקחו ביום פריחה. אינדקס פריצות מהקרקע,.Bground index נותח אינדקס נגזר המתאר את עוצמת הפריצות מהקרקע. נוצר ע"י חלוקה של "ענפים מהקרקע" ב"סה"כ ענפים". נותח על פי המדדים שנלקחו ביום פריחה. אינדקס צמיחת גובה,.H.Gro index אינדקס נגזר המתאר את עצמת הצמיחה נוצר מהכפלת לגובה. "גובה פרק" נותח על פי המדדים שנלקחו ביום פריחה. אינדקס גובה ענף, ב"מספר פרקים לפרח".branch height index.6 חלקי "גובה הצמח". אינדקס נגזר הנותן ביטוי נוסף לעצמת השלטון הקודקודי כמו גם למידת הצימוח הצריפי של הצמח. "גובה ענף" מ"גובה הצמח". נוצר מהפחתת אינדקס קצב פריחה,.flowering rate אינדקס נגזר המתאר קצב פריחה יחסי. נוצר מחלוקה של "מספר פרחים" ב "סה"כ פקעים" כפול "זמן פרח". הפרגה: המעבר של הצמח ממצב וגטטיבי לפריחה תמונה 9) מתואר במספר מדדים: שושנת עלים,.Rosetting מדד איכותי לכניסה של צמחים למצב של שושנת עלים ועיכוב יציאה של ענף פריחה. נבדק 167 יום מזריעה ב 2008 ו 172 יום מזריעה ב המדד מבחין בין שלוש רמות: 0- אין שושנת עלים, 1- שושנת עלים עם ענף פריחה, 2- שושנת עלים בלי ענף פריחה. הפרגת צאצאי הפריה עצמית,.S.offspring bolting אחוז צאצאי הפריה עצמית שהפריגו. נבדק בשלושה מועדים שונים 127,160,188 ימים מזריעה. 22

29 ג א ג ב ד הפרגת צאצאי הכלאה מחזירה,.Bc.offspring bolting אחוז צאצאי הכלאה מחזירה להורה E.grandiflorum שהפריגו. נבדק בשני מועדים שונים 141,188 ימים מזריעה. תמונה 9 הפרגה 1- צמחים שלא הפריגו במצב של שושנת עלים, 2- צמחים שהפריגו..7 מדדי יבול: אפיון של כמות הפקעים והפרחים על צמח בודד. כל המדדים נמדדו על גבי הצמח בחממה. סה"כ פקעי הפריחה,.Total floral buds נספרו כל פקעי הפריחה שיצאו מחיק העלים החפים ואורכם גדול מ 1 ס"מ והפרחים בכל שלבי ההתפתחות. נבדק בזמן פריחה ו 189 יום מזריעה איור 5.3). מספר פקעי פריחה על הענפים הראשיים,.#floral buds main נספרו כל פקעי הפריחה שיצאו מחיק העלים החפים ואורכם גדול מ 1 ס"מ והפרחים בכל שלבי ההתפתחות, בכל הענפים מלבד הענפים הפורצים מהקרקע. נבדק בזמן פריחה איור.5.1 מספר פקעי פריחה על פריצות מהקרקע,.#floral buds ground נספרו על גבי הענפים הפורצים מהקרקע כל פקעי הפריחה שיצאו מחיק העלים החפים ואורכם גדול מ 1 ס"מ והפרחים בכל שלבי ההתפתחות. נבדק בזמן פריחה איור 5.2). אינדקס פקעים ענפים,.BudBranch index מדד נגזר המתאר את כמות הפקעים על גבי ענף. נוצר מחלוקה של "סה"כ פקעי פריחה" ב"סה"כ ענפים". נותח על פי המדדים שנלקחו ביום פריחה. 23

30 א ב ה ב א ג מספר פרחים,.Flower num מספר הפרחים משלב התפתחות 3 והלאה על גבי.8 הצמח. נמדד ביום בו הפרח הראשון הגיע לשלב התפתחות 9 סיים פריחה). מאפייני סוף גידול: בעקבות שונות בין הצמחים שהובחנה לאחר הבשלת הפירות, בוצעו מספר אפיונים באופן איכותי בשטח הגידול: הצהבה,.Yellowing הצמחים נבחנו להצהבה\אי-הצהבה לאחר הבשלת הפירות. נבדק 318 יום מזריעה תמונה 10.1). ברכיבלסט,.brachyblast הצמחים נבחנו ליצירה\אי-יצירה של ענפים חיקיים מעוותים דמויי ברכיבלסט, הפירות. נבדק 318 יום מזריעה בעלי פרקים קצרים ופקעי פריחה, תמונה 10.2). לאחר הבשלת איור 5 מספר פקעי פריחה 1- מספר פקעי פריחה על ענפים ראשיים מהקרקע 4), 3- סה"כ פקעי פריחה. 15), 2- מספר פקעי פריחה על פריצות תמונה 10 מאפייני סוף גידול 1- הצהבה של הצמח לאחר הבשלת פירות, 2- יצירת איברים דמויי מדדי אנטומיה ומורפולוגיה:.1 פרח: מאפייני הפרח השלם ואברי הפרח השונים. כל המדידות הכמותיות בוצעו בשלב התפתחותי 7 אנטזיס), במעבדה, על הפרח השלישי שפרח בצמח. אורך עוקץ הפרח,.Pedicel length אורכו של הפרק האחרון בגבעול הראשי הנושא את הפרח בס"מ. תמונה 11.4). בס"מ אורך עלי גביע,.Sepal length נמדד בסרגל אורך עלה הגביע הארוך ביותר תמונה 11.5). מספר אבקנים,.Number of stamens נספרו מספר האבקנים. נספרו רק אבקנים רגולריים ללא עיוותים תמונה 11.1). 24

31 ז ד ו א ה.stigma lobe מספר אונות # צלקת, נספרו מספר אונות הצלקת תמונה.11.2,3 מספר עלי כותרת,.Number of petals נספרו עלי כותרת רגולריים, ללא עיוותים. משקל פרח,.Flower weight הפרח נשקל כיחידה אחת ללא עוקץ הפרח בגרם. צבירת צבע בפקעי הפריחה,.Floral buds color נבדק באופן איכותי עם קיים/לא קיים צבע בפקע, שלב 2 תמונה 12). תמונה 12 צבירת צבע בפקע פריחה. 1- פקע ללא צבירת צבע, 2- פקע עם צבירת צבע. בנוסף למדדים הנ"ל, תכונות איכותיות- בדידות). שייכים לקטגוריה זו ארבעת האפיונים שפורטו בסעיף תמונה 11 מדידות פרח 1 שני דוגמאות לשוני במספר אבקנים, 2- פרח עם שלוש אונות צלקת, 3- פרח עם שתי אונות צלקת, 4- אורך עוקץ הפרח,pedicel) 5- אורך עלה גביע. מורפולוגית פרי: נמדדו מספר מאפייני פרי, במעבדה, שחורים) וירוקים. כל מדידות האורכים נמדדו בסרגל בס"מ. על פירות בשלים זרעים אורך פרי,.Fruit length נמדד מעוקץ הפרי למקור הפרי, בפרי הגדול ביותר מחמישה פירות שנקטפו תמונה 13). 25

32 ב ג ו ד ה ז רוחב פרי,.Fruit width נמדד בפרי בשל, הגדול ביותר מחמישה פירות שנקטפו במקום הרחב ביותר תמונה 13). שטח פרי, הפרי,.Fruit area סמ"רתמונה 13). מדד מייצג בלבד שנגזר מאורך הפרי כפול רוחב מעוגלות הפרי,.Fruit roundness רוחב הפרי חלקי אורך הפרי. מספר עוקצי הביצית,.#funicle מספר ממוצע של האיבר הנושא את הזרעים בתוך הפרי. נלקח ממוצע של חמש פירות תמונה 14). פסיאצית פרי,.fruit Fasciation נלקחו ערכים איכותיים לפי התבוננות, 1- ללא פסיאציה, 2- פסיאציה קלה, 3- פסיאציה חזקה תמונה 15). פרי בתוך פרי,.FIF מדד יחסי של כמות הפירות בהם נוצרה צורה נוספת של פרי בתוך פרי מתוך חמישה פירות תמונה 16). תמונה 14 מספר עוקצי הביצית Funicle) 1- פרי בעל 4 איברים נושאי זרעים בפרי, 2,3- פרות בעלי 6 איברים נושאי זרעים בפרי. תמונה 13 מורפולוגית פרי תמונה 15 פסיאצית פרי 1- פרי ללא פסיאציה, 2- פסיאציה קלה, 3- פסיאציה חזקה תמונה 16 יצירה של פרי בתוך פרי FIF) 26

33 א ב ג ד ו ח ז ה ט י 3. מורפולוגית עלים: צורת העלים נמדדה תוך שימוש בתוכנת WinFOLIA 2004a התוכנה משתמשת בתמונות סרוקות של עלים לאפיון.Regent instruments Inc.) מורפולוגית העלה תוך מדידה של ערכים שונים תמונה 17). אפיון העלים בוצע על עלה היוצא מפרק חמישי, 194 יום מזריעה. בנוסף, מספר מדדי עלים נלקחו גם ידנית בעזרת סרגל ביום פריחה. כל המדידות בס"מ. שטח עלה,.Leaf Area היקף עלה,.Leaf Perimeter רוחב עלה,.Leaf HorizontalWidth רוחבו של העלה במקום הרחב ביותר. העלה נמדד שוב ביום פריחה תוך שימוש בסרגל. אורך עלה,.Leaf Vertical Length רוחבו של העלה במקום הארוך ביותר. העלה נמדד שוב ביום פריחה תוך שימוש בסרגל. יחס אורך רוחב עלה, AspectRationW/L).Leaf רוחב העלה מחולק באורך העלה. העלה נמדד שוב ביום פריחה תוך שימוש בסרגל. קבוע צורת עלה,.Leaf Form Coefficient קבוע צורה שמחושב ע"י התוכנה P כאשר A 4πA. 2 P לפי הנוסחה: שטח עלה, היקף עלה. כיוון שהעלה של ליזיאנטוס הינו עלה פשוט הערך מבטא בעיקר עד כמה העלה עגול: ערך גבוהה יתאר עלה עגול וערך נמוך יתאר עלה מאורך. אורך במקסימום רוחב,.Leaf PosiMaxPerpWidth המרחק האורכי מבסיס העלה לקו הרוחב בו העלה רחב ביותר. אורך במקסימום רוחב חלקי אורך,.Leaf PMPWidth/length המרחק מבסיס העלה וקו הרוחב בו העלה רחב ביותר מחולק לאורך המקסימאלי של העלה. רוחב ב- 50,.leaf PerpWidth50 רוחב העלה במחצית אורכו. רוחב ב- 90,.leaf PerpWidth90 רוחב העלה ב- 90% מאורכו. יא) יחס רוחב ב- 90 רוחב ב- 50,.leaf PrWidthv 90/50 רוחב העלה ב- 90% מאורכו חלקי רוחב העלה ב- 50% מאורכו. יב) זוית ב- 10%,.leaf LobeAngle10 הזווית שנוצרת בין שני קווים ישרים היוצאים מבסיס העלה לשני נקודות הקיצון בקו המשרטט את רוחבו של העלה ב- 10% מאורכו. 27

34 א א יג) זווית ב- 25%,.leaf/petal LobeAngle25 הזווית שנוצרת בין שני קווים ישרים היוצאים מבסיס העלה לשני נקודות הקיצון בקו המשרטט את רוחבו של העלה ב- 25% מאורכו. יד) יחס זווית ב- 10% זווית ב- 25%,.leaf/petal LoAngle 10/25 זווית ב- 10% חלקי זווית ב- 25%. 4. מורפולוגית עלי כותרת: האפיון בוצע באופן זהה לאפיון מורפולוגית העלה. עלה כותרת אקראי מפרח שלישי בשלב 7 שימש כבסיס למדידות. בנוסף ל- 14 המדידות שבוצעו על העלים בוצעה מדידה נוספת: אורך צבע בסיס עלה כותרת,.Petal adaxial base size במידה וקיים צבע נמדד אורכו בצורה ידנית תוך שימוש בתוכנת.WinFolia תמונה 17 WinFolia מדידות עלים סרוקים בתוכנת.WinFolia 1- עלי כותרת, 2- עלים פרק חמישי. מדדי פריון: עקרות: מספר משפחות הראו סוגים שונים של ניוון מערכת הרביה הזכרית. עקרות זכרית,.male sterility נלקחה קריאה בעיקר במשפחות מתפצלות לתופעה: 0- איברי רבייה זכריים תקינים, 1- איבריי רבייה זיכריים מנוונים..1 28

35 א ב א ב זרעים: הובחנו שני מדדים לאפיון של כמות הזרעים שהצמח מייצר באופן ספונטני. חנטה ספונטנית,.fruit set יחס הפירות בהם יש זרעים באופן ספונטני ללא התערבות) מתוך 5 פירות. set,seed כמות זרעים. מדד איכותי לכמות הזרעים שנוצרת בפרי באופן ספונטני. נלקח ממוצע לחמש פירות. 0- אין זרעים, 1- מספר זרעים בודדים, 2- הרבה זרעים, פרי לא מלא, 3- פרי מלא זרעים תמונה 18)..2 תמונה 18 כמות זרעים בפרי 1- פרי חסר זרעים, 2- פרי עם מספר זרעים בודדים, 3- פרי עם הרבה זרעים, 4- פרי מלא. 2. נביטה: בוצעו מבחני נביטה על מנת לעמוד את איכות הזרעים. יש להתייחס למדדים אלו באופן איכותי כיוון שגודלם הקטן של הזרעים מקשה על דיוק במספר הזרעים הנזרעים. נביטה הפריה עצמית, % germination.self אחוז התאים בהם נבטו זרעי הפריה עצמית מתוך 30 תאים בהם נזרעו. נביטה הכלאה מחזירה, % germination.bcgr אחוז התאים בהם נבטו זרעי הכלאה מחזירה להורה E.grandiflorum מתוך 30 תאים בהם נזרעו..5.8 ניתוח סטטיסטי על מנת לבדוק לבחון את ההתפלגויות של התכונות הכמותיות הבדידות להתפצלות מנדלית צפויה בוצעו מבחני χ 2 בשיטת "Pearson" תוך קביעת סף קבלה של 0.05=α. המבחנים בוצעו בעזרת תוכנת.SAS Institute Inc.) JMP7 Phenom Network.5.9 בוצע שימוש ב Phenom Network התפצלות תכונות לאורך הדורות. ראה מבוא) ככלי לבחינת אילני יוחסין שונים ובחינת 29

36 תוצאות.6.1 מס' הדורים של עלי כותרת על מנת לבחון את דרך הורשת הדורים הכפולים, נבחנה השערה לפיה זהו מנגנון גנטי של גן יחיד בעל שתי אללים. האלל W לדור כפול דומיננטי על אלל w לדור יחיד. לצורך הבדיקה, אופיינה אוכלוסיית המחקר הגנטי הלבנה שמתפצלת לתכונה. לפרחים כפולים בעלי יותר מדור אחד. הממצאים נבדקו בעזרת מבחן 2 χ האפיון מבדיל בין צמחים בעלי דור בודד של עלי כותרת לפי היחסים המצופים מהמנגנון המשוער. בעונה 2008 בה כמות הצמחים בכל אוכלוסיה הייתה גדולה יחסית, נבחנו היחסים בכמויות הצמחים בכל תא משפחתי טבלה 1). בעונה 2009, בה התאים המשפחתיים היו קטנים יחסית והכילו בממוצע 10 צמחים בלבד, נבחנו היחסים בין הכמויות בתאים המשפחתיים שהראו פנוטיפ/ים מסוימים טבלה 2). בנוסף, על מנת לבסס את התוצאות ברקע גנטי שונה, נבחרו מספר משפחות המתפצלות לתכונה ונספרו 2 בהן מספר הצמחים מכל פנוטיפ תוך התחשבות באילן היוחסין. הממצאים נבדקו בעזרת מבחן לפי χ היחסים המצופים מהמנגנון המשוער טבלה 3). למשפחות אחידות מבחינה פנוטיפית לא בוצע, לרוב, 2 מבחן χ עקב אחידותן. במשפחות אלו פנוטיפ זהה בתכונה הנמדדת והן כללו לפחות 25 צמחים. בטבלה 1, מתוארת התפצלות תכונת הדורים הכפולים באוכלוסיה הבין מינית הלבנה האוכלוסיה הורודה לא מתפצלת לתכונה). ניתן לראות שהדורים הכפולים מורשים בתורשה דומיננטית. בדור הF1 ההטרוזיגוט, כל הצאצאים הינם בעלי דור כפול. בדור הF2 אנו רואים התפצלות קלאסית לגן יחיד ביחסים של 3:1 לטובת הדורים הכפולים. ההכלאה המחזירה ל P1 הtype.E) exaltatum - Wild הינה למעשה הכלאת מבחן, כלומר, הכלאה עם הומוזיגוט רצסיבי. היחס 1:1 שצפוי בהכלאה נמצא מובהק, אם כי ערך ה Pχ 2 נמוך במקצת. בהכלאה המחזירה להורה הלבן ההומוזיגוט הדומיננטי נמצא כי כל הצמחים למעט שניים המהווים ככל הנראה זיהום ראה דיון) הינם בעלי דור כפול..6 30

37 טבלה 1: בחינת התפצלות דורים של עלי כותרת באוכלוסיית המחקר הגנטי הלבנה בעונת הטור הראשון מתאר את המשפחה. Double פנוטיפ פרח כפול, Single דור יחיד. מספרים בסוגריים מציינים את מספר הפרטים. W אלל דומיננטי לדור כפול, w- אלל רצסיבי. מבחן χ2 בוחן את ההתפצלות המנדלית הצפויה כפי שהיא מצוינת בעמודת הפנוטיפ. אוכלוסיה לבנה - דורים 2008 Line phenotype genotype Pχ 2 ) P1 E.exaltatum) Single 16) ww 1 P2 E. grandiflorum) White 31) WW 1 F1 Double 19) Ww 1 F2 הכלאה מחזירה ל- wild type) P1 הכלאה מחזירה ל- P2 הורה לבן) 3:1 Double 80):single 27) 1:1 Double 38):single 49) W_:ww 0.95 Ww:ww 0.24 Double 60) W_ 1 Single 2) 1 ww - 1 צמחים המהווים סטייה מהיחסים הצפויים, מקור הסטיות חוזר בטבלאות 6 ו 8.ומצביע על אותם 2 צמחים שמהווים ככל הנראה זיהום. משפחות אלו לא השתתפו בחישוב ה χ. 2 בשונה מטבלה, 1 שתיארה כמויות צמחים מכל פנוטיפ. טבלה 2 מתבוננת במבט רחב יותר ומתארת כמות משפחות בהן מתקיימים פנוטיפים מסויימים. לדוגמא, בדור F3 קיימות 21 משפחות בהן כל הצמחים בעלי דור יחיד; 20 משפחות בהן כל הצמחים בעלי דור כפול ו 56 משפחות המורכבות מצמחים בעלי דור יחיד וצמחים בעלי דור כפול משפחות מתפצלות). כצפוי, אנו רואים כי בכל משפחות הF1 ההטרוזיגוטיות ובכל המשפחות שהם תוצר הכלאה מחזירה לגנוטיפ הדומיננטי P2) אנו מקבלים משפחות אחידות לדורים כפולים. כל משפחות הF2 והכלאות המבחן הכלאות להומוזיגוט הרצסיבי) מראות התפצלות לתכונה. במשפחות F3 כמו גם, המשפחות שהינן תוצר הפריה עצמית להכלאות מחזירות, קיימות כצפוי משפחות שאינן מתפצלות ומשפחות מתפצלות. כל היחסים נמצאו מובהקים, אם כי, קיימים מספר ערכי ) 2 Pχ נמוכים במקצת. ניתן להסביר את הערכים הנמוכים בכך שכאשר אנו מתקדמים לאורך הדורות נוצרת העצמה של הסטיות שמקורן בדורות הקודמים. 31

38 טבלה 2: בחינת התפצלות דורים של עלי כותרת בין תאים משפחתיים באוכלוסיית המחקר הגנטי הלבנה בעונת הטור הראשון מתאר את סוג המשפחה. הטור השני מתאר את הפנוטיפים הקיימים במשפחה. מבחן χ2 בוחן את ההתפצלות המנדלית הצפויה כפי שהיא מצוינת בעמודת הצפי להתפלגות המשפחות ב%. אוכלוסיה לבנה דורים 2009 סוג משפחה כמות המשפחות הדורים במשפחה: צפי להתפלגות המראות את סוג 1- דור יחיד המשפחות ב% הדורים 2- דור כפול Pχ 2 ) P1 E. exaltatum) P2 E. grandiflorum) F F2 1, F ,2 הכלאה מחזירה ל- wild ) P1 1, type הפריה עצמית להכלאה מחזירה ל , P ) 0 הכלאה מחזירה ל- P2 הורה לבן , ) משפחות המהוות סטייה מהיחסים הצפויים, משפחות אלו לא השתתפו בחישוב ה χ. 2-2 משפחות המהוות סטייה מהיחסים הצפויים, מקור הסטיות חוזר בטבלאות 1 ו 5.ומצביע על אותם השתתפו בחישוב ה χ. 2 הפריה עצמית להכלאה מחזירה ל- P2 2 צמחים שמהווים ככל הנראה זיהום. משפחות אלו לא בטבלה 3, מתוארת התפצלות תכונת הדורים הכפולים במשפחות בעלות רקעים גנטיים שונים. כל שורה בטבלה מתארת את דור ההורים P1 וP2 ) דור F1 ודור F2 של קו סלקציה כלשהוא. יש לזכור, הזנים המסחריים שמתוארים בטבלה כמספרים עם האות L, הנם מכלואים ולכן לא בהכרח הומוזיגוטיים. לא לכל הקווים יש נתונים על כל הדורות כיוון שלא תמיד המשכנו לקדם את הקו או כיוון שלא ביצענו תמיד ספירה פנוטיפית מדויקת. על אף שכל שורה מתארת אילן יוחסין ספציפי, ניתן לראות כי יש גנוטיפים שחוזרים במספר שורות, לדוגמא, הזן המסחרי L12 חוזר בשורה 2 בדור F1 כיוון שהוא מכלוא) אבל הוא משמש גם הורה בשורות 2 ו 3. היחסים המשוערים לפי המודל מצוינים בעמודת הפנוטיפ וכולם מלבד היחס ב 049_07 שורה אחרונה) נמצאו מובהקים. 32

39 טבלה 3: בחינת התפצלות דורים של עלי כותרת במשפחות שונות. השורה הראשונה מתארת את דור המשפחה. Double פנוטיפ פרח כפול, Single דור יחיד. מספרים בסוגריים מציינים את מספר הפרטים. W אלל דומיננטי לדור כפול, w- אלל רצסיבי. מבחן χ 2 בוחן את ההתפצלות המנדלית הצפויה כפי שהיא מצוינת בעמודת הפנוטיפ. P1 P2 F1 F2 Line phenotype genotype Line phenotype genotype Line phenotype genotype Pχ 2 ) Line phenotype genotype Pχ 2 ) L21 double Ww L12 double Ww 06_293 L20 single ww L12 double Ww 06_287 L08 double Ww 06_232 L12 double Ww 06_236 3:1 Double24): single80) 1:1 Double85): single91) W_:ww 0.65 Ww:ww 0.65 L02 double Ww L03 double Ww L2L3* double Ww 07_001 L07 double Ww 07_035 L10 single ww L16 double Ww 06_266* double Ww 07_060 L16 double Ww L16 double Ww 06_240.1* double Ww 07_318 L2L3 Double* Ww Gr Single ww 07_122 1:1 Double18): single18) Ww:ww 1 06_238 double Ww 07_049 3:1 Double134): single52) 3:1 Double154): single47) 3:1 Double28): single7) 3:1 Double35): single13) 3:1 Double73): single23) 3:1 Double23): single7) 3:1 Double17): single20) W_:ww 0.35 W_:ww 0.6 W_:ww 0.49 W_:ww 0.74 W_:ww 0.81 W_:ww 0.83 W_:ww 0.003** * - סלקציה לצמח ספציפי במשפחה מתפצלת **- האוכלוסיה לא מתפצלת באופן מובהק כצפוי מהיחסים המנדלים. 33

40 ה 6.2. צבע עלי כותרת תורשת צבע עלי הכותרת נבחנה להתאמה למודל של שני גנים בעלי יחסים של אפיסטזיס רצסיבי איור 6). המנגנון נבחן באופן זהה למתואר בבחינת מנגנון הורשת הדורים. המנגנון נבחן על גבי שתי האוכלוסיות הגנטיות, בעונה 2008 בתוך תאים משפחתיים טבלה 4) ובעונה 2009 בין תאים משפחתיים טבלה 5). בנוסף, לביסוס הממצאים, בוצעה בדיקה של מספר אוכלוסיות מתפצלות ברקעים גנטיים שונים טבלה 6). במנגנון המוצע הצבע הסגול דומיננטי על הצבע הורוד והלבן, הצבע הורוד דומיננטי ללבן. בנוסף, קיים מיסוך של הצבע הסגול במידה והגן לצבע הורוד במצב רצסיבי איור 6). גן V גן S סגול ורוד לבן ורוד s V V s לבן S v v S או לבן s v v s סגול S V V S F1 סגול) V v S s F2 סגול) _ S 9 V _ ורוד) 3 V _ s s לבן) _ S 3 v v לבן) 1 v v s s איור 6 מנגנון אפיסטזיס רצסיבי להורשת צבע עלי כותרת טבלה 4 זהה באופיה לטבלה 1, מתארת את התפצלות הצבע באוכלוסיה הבין מינית הלבנה והורודה. ניתן לראות כי משפחות הF1 ההטרוזיגוטיות הינן אחידות לצבע הסגול הדומיננטי. אוכלוסיות הF2 מראות התפצלות מנדלית צפויה באוכלוסיה הלבנה לפי מנגנון אפיסטזיס רצסיבי). משפחות ההכלאה המחזירה לP1.E) exaltatum - Wild type מתארות הפעם הכלאה לגנוטיפ הדומיננטי ולכן אנו רואים אחידות לצבע 34